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全長轉(zhuǎn)錄組測序

技術(shù)簡介

基于Pacbio單分子實時測序技術(shù)(Single Molecule Real-Time Sequencing,SMRT),借助其超長讀長優(yōu)勢,無需組裝,直接獲得從5’末端到3’PolyA尾的高質(zhì)量的全長轉(zhuǎn)錄本信息。利用全長轉(zhuǎn)錄組測序,可獲取全長mRNA序列,對基因異構(gòu)體、可變剪切、融合基因進行準確鑒定。

技術(shù)路線

送樣建議

樣本類型

濃度   (Qubit)

總量

完整性及純度

Total RNA

≥300 ng/μL

≥10 μg

RIN≥8.028S/18S≥1.3;基線平整,5S峰正常;OD260/280≥1.8OD260/230≥1.8

 技術(shù)參數(shù)

測序策略

數(shù)據(jù)量

周期

三代全長轉(zhuǎn)錄組測序

PacBio RS II

15G data

95 個自然日

 案例分析

全長轉(zhuǎn)錄組測序揭秘玉米轉(zhuǎn)錄組的復雜性[1]

研究背景

玉米(Zea mays)是全球重要的農(nóng)作物,也是研究植物轉(zhuǎn)錄組代謝通路的遺傳模型。玉米基因組序列于2009年公布,后續(xù)利用ESTRNA-Seq轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)對其基因注釋進行了補充。然而RNA-Seq中,短讀長無法提供轉(zhuǎn)錄本全長序列,限制了可變剪接形式的鑒定等。

研究方

采集玉米自交系B73不同發(fā)育階段的6個組織(根、花粉、胚芽、胚乳、幼雌穗、幼雄穗),提取mRNA,構(gòu)建6種插入片段文庫(<1, 1–2, 2–3, 3–5, 4–6 >5 kb),進行全長轉(zhuǎn)錄組測序和二代RNA-Seq測序(每個樣品三個重復)。

圖1. 新鑒定LncRNA分析

研究結(jié)果

測序得到的全長轉(zhuǎn)錄本序列,其中有94.2%能夠比對到玉米RefGen_v3參考基因組上。經(jīng)聚類分析得到了來自53個家族(RefGen_v3總共57個)的新的isoform,對應(yīng)26,943個基因,轉(zhuǎn)錄因子5,423個,其中155個與生長激素應(yīng)答功能相關(guān)。而鑒定的878個候選LncRNA中,867個(平均讀長為1.1kb)為新發(fā)現(xiàn)的LncRNA,具有結(jié)構(gòu)和組織特異性。進一步對isoformlncRNAnon-lncRNA區(qū)域進行甲基化分析,發(fā)現(xiàn)non-lncRNA genes具有相對較高的CG甲基化水平,而lncRNAs具有相對較高的CHG甲基化水平,這些甲基化水平可能與玉米不同組織中基因的不同表達水平有關(guān)。

研究結(jié)論

PacBio超長讀長無需組裝即可得到全長轉(zhuǎn)錄組信息,相比于Illumina短讀長組裝的isoform而言,更能直接準確地獲得isoform信息,有助于解密玉米轉(zhuǎn)錄組復雜的基因表達信息。

 

參考文獻

[1]. Wang B, Tseng E, Regulski M, et al. Unveiling the complexity of the maize transcriptome by single-molecule long-read sequencing[J]. Nature Communications, 2016, 7:11708.

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